細菌培養(yǎng)

(一) 病料采集和運送　對動物進行病原菌檢疫，病料的采集和運送是否得當，是關系到能否分離到病原菌的關鍵。首先充分了解各種病原菌（目的菌）在被檢動物體內及其分泌物和排泄物中的分布情況，不同的病原菌在患病動物體內分布情況不同，即使是同一種病原菌，在病的不同時期和不同的病型中分布也不同。在采取病料前必須對被檢動物可能患有何種疫病作出初步診斷。采取病料所用器械和宣傳品器都應事先消毒，確保無毒，采樣時應無菌操作。如果動物已死亡，取樣應注意以下幾點：⑴ 對急性死亡的動物，從耳尖或四肢末梢血管取血制成涂片，染色鏡檢，在排除炭疽后方能剖檢取樣；⑵ 采取病料時間，原則是越早越好，夏季要在動物死亡后2小時內采取病料；⑶ 為了提高病原微生物的陽性分離率，采取的病料要盡量可能齊全，除了內臟、淋巴結和局部病變組織外，還應采取腦組織和骨髓，以防遺漏；⑷ 認真填寫好病料送檢單和剖檢病理變化記錄。下面介紹病料的采取方法。

1. 膿汁　先將表面流水線，然后以滅菌注射器或吸管抽取深部的濃汁；若是開口化膿灶或皮膚、粘膜表面化膿，可用滅菌棉拭子浸沾膿汁后，放入試管中。

2. 內臟器官　采取心、肺、肝、脾、腎等有病變的組織及其淋巴結，無病變時也要采取，無菌剪取1－2cm大的方塊，分別裝入滅菌容器內。

3. 血液　要全血時，無菌采取血液10m，立即注入盛有含0.5％肝素溶液0.1ml或5%檸檬酸鈉液1ml的滅菌試管內，并立即混合均勻。要分離血清時，將無菌采取的血液直接注入滅菌試管，待血液自然凝固后分離血清。從尸體采取血液時，可用滅菌注射器或吸管從右心房抽取。

4. 皮膚和粘膜　采取病變局部的皮膚和粘膜及其所屬淋巴結，放入甘油鹽水溶液中。

5. 腦和脊髓　無菌采取腦的脊髓約1－2cm大的方塊，放入甘油鹽水溶液中。

6. 膽汁　用滅菌注射器抽出后放入滅菌試管中。

7. 腸和胃　剪取有病變的部位一段或一塊。也可將腸管一段（約6－8cm）用線扎緊兩端后剪下送往實驗室。

8. 糞便　可用棉拭子插入肛門沾取，或撲殺病畜后由腸管采取，立即放低溫條件下保存。

9. 乳汁　先用消毒藥液洗凈乳頭及其附近，棄去最初擠出的幾滴乳汁，然后采取乳汁約10ml放入滅菌試管內。

10. 流產胎兒　可將整個胎兒用塑料薄膜包緊，裝入箱中送檢。

11. 小動物、禽和魚等可按上述流產胎兒方式整體送檢。在距離實驗室很近，又有隔離運輸條件時，也可將發(fā)病小動物直接送檢。

(二) 病料的處理　采集的病料，在接種培養(yǎng)前，應對其性狀進行觀察，例如：是否膿性帶血或腐敗，有何異味，并作記錄。各種病料在分離培養(yǎng)前均應制備一張涂片，作革蘭氏染色、鏡檢，以了解細菌的形態(tài)、染色特性，并大致估計其含菌量。通過肉眼觀察和顯微鏡下看到的結果，對病料中可能含有的病原菌作最初步的估價。

如果病料是病變組織，又是用無菌方法采集的，在接種前一般無需作特別處理。但如果病料被雜菌污染嚴重，則需根據(jù)要分離的病原菌的特性，采用一些對病原菌無害，但對雜菌有殺滅或抑制作用的方法，以抑制雜菌生長。例如從糞便中分離沙門氏桿菌，可將糞合接種于亞硒酸鈉肉湯中，作增菌處理。在這種培養(yǎng)基中，其它雜菌被抑制，而沙門氏桿菌則能自由繁殖。又如，分離布魯氏桿菌、胎兒彎曲桿菌、炭疽桿菌、副結核桿菌可用選擇性抗菌瓊脂。分離鏈球菌和豬丹毒桿菌用疊氮鈉結晶紫血瓊脂等。如果從腸道內容物或從污染有不產生芽胞的雜菌培養(yǎng)物中分離能形成芽胞的細菌（如魏氏梭菌、破傷風梭菌等），可將病料在80℃加熱15分鐘，以殺死不形成芽胞的雜菌，取此材料再接種培養(yǎng)基，即容易獲得純培養(yǎng)物。有些病料（如奶、尿等）含菌太少，則應先作集菌處理，然后接種，以提高檢出率，其集菌方法有離心法和過濾法。離心法取沉淀物作培養(yǎng)物；過濾后取沉積于濾板上表面的病料作培養(yǎng)。還有些細菌往往在細胞漿內集結成團，在它們所形成的病灶中含菌較少，遇到這種情況，可將病料組織磨碎，制成乳劑，加入酶、酸或堿，消化組織，使菌團散開，然后離心，收集沉淀物作培養(yǎng)（如從腸粘膜分離副結核桿菌即用此法）。

(三) 細菌的分離與接種　培養(yǎng)細菌時，須將標本或細菌培養(yǎng)物接種于培養(yǎng)基上，常用接種方法有以下幾種。

1. 平板劃線接種法　本法為最常用的分離培養(yǎng)細菌的方法，通過平板劃線后，可使細菌分散生長，形成單個菌落，有利于從含有多種細菌的標本中分離出目的菌。分離培養(yǎng)用的平板培養(yǎng)基應表面干燥，可于臨用前置37℃孵育箱內30分鐘，這樣表面即干燥有利于分離培養(yǎng)，又使培養(yǎng)基預溫，對培養(yǎng)某些較嬌弱的細菌有利。常用的平板劃線接種法有以下幾種。

(1) 分區(qū)劃線法　此法多用于膿汁、糞便等含菌量較多的標本的分離。其方法是首先將接種環(huán)滅菌后，沾取標本均勻涂布于平板培養(yǎng)基邊緣一小部分（第一區(qū)），將接種環(huán)火焰滅菌，待冷卻后只通過第一區(qū)3－4次后連續(xù)劃線（為第二區(qū)），依次可共劃線3－5區(qū)，每一區(qū)細菌數(shù)可逐漸減少，直到分離出單個菌落為止。

(2) 連續(xù)劃線法　該法多用于含菌數(shù)量較少的標本。其方法是首先用白金耳將標本均勻涂布于平板培養(yǎng)基邊緣一小部分，然后由此開始，在培養(yǎng)基表面自左向右連續(xù)劃線并逐漸向下移動，直到下邊緣。

劃線接種時，盡可能作到直、密、勻，有效地利用培養(yǎng)基表面達到充分分離的目的。如果標本含菌較多，接種在強選擇培養(yǎng)基（如SS瓊脂）上時或標本含菌較少時，采用分區(qū)劃線法接種，接種環(huán)可一直劃完各區(qū)皿內，中間不必滅菌。

2. 斜面接種法　采用該法目的是進行純培養(yǎng)。其方法是從平板分離培養(yǎng)物上用接種環(huán)挑取單個菌落或者是取純種，移種至斜面培養(yǎng)基上，先從斜面底部自下而上劃一條直線，再從底部開始向上劃曲線接種，盡可能密而勻，或者直接自下而上劃曲線接種。

3. 傾注培養(yǎng)法　此法適用于乳汁和尿液等液體標本的細菌計數(shù)。其方法是取原標本或經適當稀釋（一般是10-1 －10-5倍稀釋）的標本1ml，置于直徑9cm無菌平皿內，傾入已融化并冷至50℃左右的培養(yǎng)基約15ml，立即混勻待凝固后倒置于37℃培養(yǎng)18－24小時，做菌落計數(shù)。

4. 穿刺接種法　本法多用于雙糖、明膠等具有高層的培養(yǎng)基進行接種。方法是用接種針挑取菌落或培養(yǎng)物，由培養(yǎng)基中央直刺到距管底約0.3－0.5cm處。然后沿穿刺線退出接種針，若為雙糖等含高層斜面的培養(yǎng)基則光穿刺高層部分，退出接種針后直接曲線接種斜面部分。

5. 液體接種法　本法多用于普通肉湯，蛋白胨、水等液體培養(yǎng)基的接種。其方法是接種環(huán)沾取菌種，傾斜液體培養(yǎng)基管，先在液面與管壁交界處研磨接種物（以試管直立后液體能淹沒接種物為準），然后再在液體中擺動2－3次接種環(huán),塞好棉塞后輕輕混合即可。

(四) 細菌的培養(yǎng)方法　根據(jù)培養(yǎng)細菌的目的和培養(yǎng)物的特性培養(yǎng)方法分為一般培養(yǎng)法、二氧化碳培養(yǎng)法和厭氧培養(yǎng)法三種。

1. 一般培養(yǎng)法　將已接種過的培養(yǎng)基,置37℃培養(yǎng)箱內18－24小時,需氧菌和兼性厭氧菌即可于培養(yǎng)基上生長。少數(shù)生長緩慢的細菌，需培養(yǎng)3－7天直至一個月才能生長。為使培養(yǎng)箱內保持一定濕度，可在其內放置一杯水。培養(yǎng)時間較長的培養(yǎng)基，接種后應將試管口塞棉塞后用石臘凡士林封固，以防培養(yǎng)基干裂。

2. 二氧化碳培養(yǎng)法　某些細菌，如牛流產布氏桿菌和胎兒弧菌等需要在含有10％二氧化碳的空氣中才能生長，尤其是初代分離培養(yǎng)要求更為嚴格。將已接種的培養(yǎng)基置于二氧化碳環(huán)境中進行培養(yǎng)的方法即二氧化碳培養(yǎng)法，常用方法有以下幾種：

(1) 二氧化碳培養(yǎng)箱　可將已接種的培養(yǎng)基直接放入箱內孵育，即可獲得二氧化碳環(huán)境。

(2) 燭缸法　將已接種的培養(yǎng)基，置于容量為2 000ml的磨口標本缸或干燥器內。缸蓋或缸口處均需涂以凡士林，然后點燃蠟燭直立置入缸中，密封缸蓋。待燃自行熄滅時，容器內約含5－10％的CO2 容器置37℃培養(yǎng)。

(3) 重碳酸鈉－鹽酸法　每升容積的容器內，重碳酸鈉與鹽酸按0.4g與3.5ml的比例，分別將兩種藥各置一器皿內（如平皿內），連同器皿置于標本缸或干燥器內，蓋嚴后使容器傾斜，兩種藥品接觸后即可產生二氧化碳。

3. 厭氧培養(yǎng)法　目前常用的厭氧培養(yǎng)方法有厭氧罐法、氣袋法及厭氧箱三種。

(1) 厭氧罐法　是目前應用較廣泛的一種方法，共分為以下幾種。

抽氣換氣法：該法適用于一般實驗室，其特點是較經濟并可迅速建立厭氧環(huán)境。標本接種后，將平板放入?yún)捬豕?，擰緊蓋子，用真空泵抽出罐中空氣，使壓力真空表至-79.98KPa，停止抽氣，充入高純氮氣使壓力真空表指針回0位,連續(xù)反復3次,最后在罐內-79.98KPa的情況下,充入70%的N2 、20%H2 、10%CO2 （有人改用20%CO2 及80%H2 ,亦可獲得好結果）。罐中需放入冷催化劑鈀粒，可催化罐中殘余的O2 和H2 化合成水。同時罐中應放有美藍指示管，美藍在有氧的環(huán)境下呈藍色，無氧時為紅色。臨用前首先將美藍煮沸使變成無色，放入罐中先呈淺藍色，待罐中無氧環(huán)境形成，美藍即可持續(xù)無色。

氣體發(fā)生袋法：氣體發(fā)生袋系由錫箔密封包裝，其中含有兩種藥片，一種為含枸椽酸和重碳酸氫鈉的藥片，另一種是含有硼氫化鈉的藥片。前者遇水放出二氧化碳，后者可釋放氫。使用時在袋的右上角剪一小口，灌進10ml蒸餾水，立即放入含有鈀粒、指示劑及平板培養(yǎng)基的厭氧罐中，擰緊蓋子經2－3分鐘后，可感到蓋子微熱并有少量水蒸氣出現(xiàn)。密封后1小時左右罐中的O2 的含量可低于＜1%。

(2) 氣袋法　此種方法不需要特殊設備，操作簡單，使用方便，不但實驗室中可用，而且外出采樣、現(xiàn)場接種也可用。原理與氣體發(fā)生袋完全相同，只是采用塑料袋代替了厭氧罐，氣袋為一透明而密閉的塑料袋，內裝有氣體發(fā)生安瓿、指示劑安瓿、含有催化劑的帶孔塑料管各一支。其操作方法為首先將接種的平板培養(yǎng)基放入袋中，用彈簧夾夾緊袋口，然后用手指壓碎氣體安瓿，20分鐘后再壓碎指示劑安瓿，如果指示劑不變藍色，說明袋內達到厭氧狀態(tài)，即可放入37℃進行培養(yǎng)。

(3) 厭氧培養(yǎng)箱　使用之前須仔細檢查厭氧裝備有無漏氣等問題，以及催化劑、指示劑質量等。使用時嚴格遵守操作規(guī)程，保證箱內氣體比例合理。

細胞培養(yǎng)常見問題及其解決

1. 如何選用特殊細胞系培養(yǎng)基？

培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，首選MEM做粘附細胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng)是一個好的開始。

2. 何時須更換培養(yǎng)基？

視細胞生長密度而定， 或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。

3. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？

不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細胞大都無法立即適應， 造成細胞無法存活。

4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？

不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

5 何謂FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

6 培養(yǎng)細胞時應使用5 % 或10% CO2？或根本沒有影響？

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養(yǎng)時應使用的CO2 濃度。當培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細胞培養(yǎng)時應使用10 % CO2；當培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時， 則應使用5 % CO2 培養(yǎng)細胞。

7.Hank's 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別？

HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。

8. 細胞之接種密度為何？

依照細胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。

9. 懸浮性細胞應如何繼代處理？

一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中， 稀釋細胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶， 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當濃度， 重復前述步驟即可。

10.冷凍管應如何解凍？

取出冷凍管后， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時， 必須注意安全， 預防冷凍管之爆裂。

11. 細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時， 是否應馬上去除DMSO？

除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感之細胞外， 絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞）， 在解凍之后， 應直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

12. 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度？應如何處理？

一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20 °C，避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低，并可減少污染之機會。

13.欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？

欲回收動物細胞， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘， 過高之轉速， 將造成細胞死亡。

14. 細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？

動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細胞液中， 必須使用前先行配制完成。

15.DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？

冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即為無菌狀況， 第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4°C，避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質， 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。

16.冷凍保存細胞之方法？

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。

17. 細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？

冷凍管內細胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

18.培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？

除于特殊篩選系統(tǒng)中外， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下， 培養(yǎng)基中不應添加任何抗生素。

19.應如何避免細胞污染？

細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環(huán)境、與品質良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。

20.如果細胞發(fā)生微生物污染時，應如何處理？

原則上：直接滅菌后丟棄之。

當重要的培養(yǎng)污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。

高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。

1.在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細胞，稀釋到常規(guī)細胞傳代的濃度。

2.分散細胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

3.每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。

4.確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞2～3代。

5.在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一代。

6.重復步驟4。

7.在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6代，確定污染是否以已被消除。

21.支原體(mycoplasma) 污染的細胞，是否能以肉眼觀察出異狀？

不能。除極有經驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之。

22.支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響？

支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數(shù)據(jù)方有意義。

23. 偵測出細胞株有支原體污染時， 該如何處理？

直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。

24. CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？

定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去