特殊培養(yǎng)法

1）二倍體細胞培養(yǎng)法

二倍體細胞培養(yǎng)法與一般培養(yǎng)相同，關(guān)鍵在于傳代，其傳代程序為：

1. ? ? ?吸除舊培養(yǎng)液注入另瓶中。

2. ? ? ?用溫BSS沖洗1次。

3. ? ? ?用0.25%溫胰蛋白酶消化，加入消化液量以僅覆蓋細胞層即可；作用1~5分鐘。

4. ? ? ?待細胞附著松動、細胞質(zhì)邊緣卷起和間隔加大，便終止消化。為防止細胞丟失，可不必再用BSS沖洗，直接向瓶中加入培養(yǎng)液（新舊培養(yǎng)液按2：1新舊混合）。

5. ? ? ?輕輕反復(fù)吹打制成單個細胞懸液。

6. ? ? ?按一分為二比例接種培養(yǎng)。

2）支持物培養(yǎng)法

加支持物培養(yǎng)法與一般培養(yǎng)法相同，只是在培養(yǎng)前需在培養(yǎng)瓶中加入已經(jīng)消毒的支持物。

1. ? ? ?支持物制備：如用特氟隆薄膜，無菌條件下啟封，用剪刀按需要剪成各種不同大小的塊，于培養(yǎng)接種細胞前，先置入培養(yǎng)容器中即可；通常多用蓋玻片做支持物，用前先要把蓋片用玻璃刀切成一定形態(tài)，以便裝入培養(yǎng)瓶中，然后按如下順序處理：自來水浸泡24小時—96%酒精30～60 min—蒸餾水浸泡30～60 min—用干凈軟布擦拭干凈—裝入培養(yǎng)皿中—高壓或干熱滅菌備用。

2. ? ? ?培養(yǎng)法：初代消化培養(yǎng)、初代組織塊培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等皆可應(yīng)用加支持物培養(yǎng)法。接種細胞后，可在任何時間取出支持物，做各種觀察或?qū)嶒灐?/span>

3）細胞分離（克?。┡囵B(yǎng)

多孔塑料培養(yǎng)板單細胞克隆法：

1. ? ? ?消化：取健康待克隆細胞，吸出瓶內(nèi)培養(yǎng)液，加消化液。

2. ? ? ?低密度細胞懸液的制備：做克隆細胞時首先需先用消化法制備出分散成單個細胞懸液，然后稀釋細胞，使之成為1~2細胞/毫升懸液，最適宜細胞密度為1~2細胞/ml培養(yǎng)液。

3. ? ? ?接種：先用吸管輕輕吹打細胞懸液，使混懸均勻，繼用加樣器向塑料培養(yǎng)板每孔內(nèi)加0.5毫升。接種時要迅速準確，爭取在最短時間內(nèi)加完，以免培養(yǎng)液蒸發(fā)，然后迅速蓋好蓋板，置CO₂溫箱培養(yǎng)。

4. ? ? ?標記：培養(yǎng)6~12小時后，待細胞下沉冰貼附于培養(yǎng)板孔底后，從溫箱中取出，置倒置光顯微鏡臺上，觀察和標記下含有單個細胞的孔，置CO₂溫箱培養(yǎng)。在培養(yǎng)中一般無需換液，只有在細胞增長過于緩慢時才可進行換液。換液時先吸除舊培養(yǎng)基，但不要吸除過多，余少許，以免細胞干涸。然后再迅速補加新鮮克隆培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3~4周。待孔內(nèi)細胞增至500~600個時，可進行分離培養(yǎng)。

5. ? ? ?分離擴大培養(yǎng)：培養(yǎng)86~96小時后進行觀察。挑選生長良好的單細胞克隆孔，先吸除舊培養(yǎng)液，用Hanks洗1~2次，繼加胰蛋白酶少許，加入量已能覆蓋細胞群即可，如過多，應(yīng)吸除多余消化液。置于倒置顯微鏡下窺視，待發(fā)現(xiàn)細胞變圓時，加入0.1ml含10%血清的克隆培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打，當細胞離開底物懸浮后，一并吸入管內(nèi)，移入另瓶或皿中，再補加一定量克隆培養(yǎng)液，置CO₂溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)、增殖，使之形成新的細胞群后，即轉(zhuǎn)用常規(guī)培養(yǎng)法培養(yǎng)。

必須保證分離出來的細胞確為一個而不是兩個或更多。因此必須提高克隆形成率才易克隆成功，為此常采取以下一些措施：

使用適應(yīng)性培養(yǎng)基或條件培養(yǎng)基（Conditional Medium）。制備方法：

1. ? ? ?培養(yǎng)同源細胞（未克隆前時的同一細胞）至半?yún)R合狀態(tài)時，更換一次培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)24~48小時后，吸出所有培養(yǎng)液。

2. ? ? ?離心：3000~4000/分離心10分鐘，吸取上清液。

3. ? ? ?濾過：再經(jīng)直徑0.22μm濾孔的濾膜過濾，低溫凍存貯備用；用時取1分適應(yīng)培養(yǎng)基+2分培養(yǎng)基混合使用。

使用飼細胞(Feeder Cells)。制備方法：

1. ? ? ?取原代培養(yǎng)的人或動物胚胎成纖維細胞，90%匯合時制成細胞懸液，再按10⁵細胞/毫升重新接種培養(yǎng)。

2. ? ? ?在細胞半?yún)R合時，準備0.25μg/ml的絲裂霉素C，按2μg/10⁶細胞的量加入到培養(yǎng)瓶中過夜；或用射線單次照射，劑量30～50戈瑞。

3. ? ? ?細胞經(jīng)上述處理后，Hanks液漂洗兩次、更換培養(yǎng)液、再培養(yǎng)24小時，胰蛋白酶消化細胞制成懸液，按5×10⁴（10⁴細胞/cm²）接種入新培養(yǎng)基中。

4. ? ? ?48小時后，即可用于細胞克隆之用。

底物特殊處理：

1. ? ? ?制備濃度為1 mg/ml的多聚右旋賴氨酸的水溶液，用以濕潤培養(yǎng)瓶底。

2. ? ? ?倒出多聚賴氨酸溶液，用5ml PBS沖洗一次后，可立即使用，或存數(shù)周內(nèi)使用。

4）球體細胞培養(yǎng)

1. ? ? ?瓊脂鋪底的培養(yǎng)瓶：30ml無菌培養(yǎng)瓶，每瓶中加5 ml 2%瓊脂培養(yǎng)基，冷卻，形成平坦底層后備用。

2. ? ? ?取生長狀態(tài)良好已連接成片的細胞，用彎頭吸管伸入瓶內(nèi)，把細胞縱橫割劃成若干小區(qū)后，倒出培養(yǎng)液。

3. ? ? ?加入0.25%的胰蛋白酶液，在倒置顯微鏡下邊消化邊觀察，當細胞小區(qū)邊緣微卷起后便立即終止消化，倒出消化液，用Hanks輕輕漂洗一次，加入新培養(yǎng)液3~5 ml，用吸管把已松動的細胞片吸打下來，分裝入1~3個含2%瓊脂培養(yǎng)基底層的培養(yǎng)瓶中，置溫箱繼續(xù)培養(yǎng)，數(shù)日后便可生長成細胞球體。

4. ? ? ?換液：培養(yǎng)1~2日后，如需換液，微傾斜培養(yǎng)瓶，令培養(yǎng)液集于培養(yǎng)瓶底角，停片刻，待球體細胞下沉后，吸除部分培養(yǎng)液，再補充新培養(yǎng)液。

5）微載體細胞培養(yǎng)法

1. ? ? ?微載體選擇：先用利用三種小量微載體做培養(yǎng)實驗，觀察細胞在一定時間內(nèi)細胞的吸著率和計算細胞數(shù)，以得到最大量細胞為佳。

2. ? ? ?水化：稱一定量的微載體放入容器中，按每克微載體加50～100ml的比例，加入無Ca^2＋和Mg^2＋的磷酸緩沖液（PBS），室溫下放置應(yīng)不少于3小時，并不時輕微攪動，然后再用新鮮PBS洗一次。

3. ? ? ?消毒：可采用高壓蒸汽消毒，也可在水化后用70％酒精浸泡消毒，再用無菌的PBS漂洗一二次。

4. ? ? ?傳代培養(yǎng)：在連續(xù)進行微載體培養(yǎng)時，可以不必把細胞從微載體分離下來，可將帶有細胞的微載體和新的微載體混合進行培養(yǎng)細胞能移動到新載體上。如果進行其它實驗或需要分離細胞進行傳代培養(yǎng)時，和常規(guī)培養(yǎng)相同，先用EDTA＋胰蛋白酶溶液作用使細胞脫離微載體表面。細胞脫離微載體后，可用自然沉降法，即在室溫下靜止5分鐘，微載體將先自沉在底部，細胞大部分仍在上清中，然后離心上清即可得到細胞。如果需要分離程度較高時，需用孔徑為100微米的尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)過濾后，再離心濾過液，就可得到較純凈的細胞。

6）懸浮培養(yǎng)法

懸浮培養(yǎng)是使帖壁細胞呈懸浮狀態(tài)生長。如所需培養(yǎng)的細胞本身屬懸浮生長型，則無須做任何處理；在傳代時先做離心處理去除舊培養(yǎng)液，添加新培養(yǎng)液即可。但在培養(yǎng)帖附型細胞時，必須進行干擾細胞不能帖附，方法有二：

1．用大培養(yǎng)瓶增加含有鐵芯的無毒的聚苯乙烯棒，在培養(yǎng)中進行電磁攪拌，使細胞不能帖壁而成懸浮培養(yǎng)。

2．用試管培養(yǎng)細胞，把試管置入帶有旋轉(zhuǎn)鼓的特制溫箱中進行培養(yǎng)，旋轉(zhuǎn)鼓不停徐緩轉(zhuǎn)動，干擾細胞帖壁遂成懸浮培養(yǎng)。