發(fā)布時間:2021-04-09 17:38:29
1)二倍體細胞培養(yǎng)法
二倍體細胞培養(yǎng)法與一般培養(yǎng)相同,關鍵在于傳代,其傳代程序為:
1. ? ? ?吸除舊培養(yǎng)液注入另瓶中。
2. ? ? ?用溫BSS沖洗1次。
3. ? ? ?用0.25%溫胰蛋白酶消化,加入消化液量以僅覆蓋細胞層即可;作用1~5分鐘。
4. ? ? ?待細胞附著松動、細胞質邊緣卷起和間隔加大,便終止消化。為防止細胞丟失,可不必再用BSS沖洗,直接向瓶中加入培養(yǎng)液(新舊培養(yǎng)液按2:1新舊混合)。
5. ? ? ?輕輕反復吹打制成單個細胞懸液。
6. ? ? ?按一分為二比例接種培養(yǎng)。
2)支持物培養(yǎng)法
加支持物培養(yǎng)法與一般培養(yǎng)法相同,只是在培養(yǎng)前需在培養(yǎng)瓶中加入已經(jīng)消毒的支持物。
1. ? ? ?支持物制備:如用特氟隆薄膜,無菌條件下啟封,用剪刀按需要剪成各種不同大小的塊,于培養(yǎng)接種細胞前,先置入培養(yǎng)容器中即可;通常多用蓋玻片做支持物,用前先要把蓋片用玻璃刀切成一定形態(tài),以便裝入培養(yǎng)瓶中,然后按如下順序處理:自來水浸泡24小時—96%酒精30~60 min—蒸餾水浸泡30~60 min—用干凈軟布擦拭干凈—裝入培養(yǎng)皿中—高壓或干熱滅菌備用。
2. ? ? ?培養(yǎng)法:初代消化培養(yǎng)、初代組織塊培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等皆可應用加支持物培養(yǎng)法。接種細胞后,可在任何時間取出支持物,做各種觀察或實驗。
3)細胞分離(克隆)培養(yǎng)
多孔塑料培養(yǎng)板單細胞克隆法:
1. ? ? ?消化:取健康待克隆細胞,吸出瓶內培養(yǎng)液,加消化液。
2. ? ? ?低密度細胞懸液的制備:做克隆細胞時首先需先用消化法制備出分散成單個細胞懸液,然后稀釋細胞,使之成為1~2細胞/毫升懸液,最適宜細胞密度為1~2細胞/ml培養(yǎng)液。
3. ? ? ?接種:先用吸管輕輕吹打細胞懸液,使混懸均勻,繼用加樣器向塑料培養(yǎng)板每孔內加0.5毫升。接種時要迅速準確,爭取在最短時間內加完,以免培養(yǎng)液蒸發(fā),然后迅速蓋好蓋板,置CO2溫箱培養(yǎng)。
4. ? ? ?標記:培養(yǎng)6~12小時后,待細胞下沉冰貼附于培養(yǎng)板孔底后,從溫箱中取出,置倒置光顯微鏡臺上,觀察和標記下含有單個細胞的孔,置CO2溫箱培養(yǎng)。在培養(yǎng)中一般無需換液,只有在細胞增長過于緩慢時才可進行換液。換液時先吸除舊培養(yǎng)基,但不要吸除過多,余少許,以免細胞干涸。然后再迅速補加新鮮克隆培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)3~4周。待孔內細胞增至500~600個時,可進行分離培養(yǎng)。
5. ? ? ?分離擴大培養(yǎng):培養(yǎng)86~96小時后進行觀察。挑選生長良好的單細胞克隆孔,先吸除舊培養(yǎng)液,用Hanks洗1~2次,繼加胰蛋白酶少許,加入量已能覆蓋細胞群即可,如過多,應吸除多余消化液。置于倒置顯微鏡下窺視,待發(fā)現(xiàn)細胞變圓時,加入0.1ml含10%血清的克隆培養(yǎng)基,用吸管輕輕吹打,當細胞離開底物懸浮后,一并吸入管內,移入另瓶或皿中,再補加一定量克隆培養(yǎng)液,置CO2溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)、增殖,使之形成新的細胞群后,即轉用常規(guī)培養(yǎng)法培養(yǎng)。
必須保證分離出來的細胞確為一個而不是兩個或更多。因此必須提高克隆形成率才易克隆成功,為此常采取以下一些措施:
使用適應性培養(yǎng)基或條件培養(yǎng)基(Conditional Medium)。制備方法:
1. ? ? ?培養(yǎng)同源細胞(未克隆前時的同一細胞)至半?yún)R合狀態(tài)時,更換一次培養(yǎng)液,再繼續(xù)培養(yǎng)24~48小時后,吸出所有培養(yǎng)液。
2. ? ? ?離心:3000~4000/分離心10分鐘,吸取上清液。
3. ? ? ?濾過:再經(jīng)直徑0.22μm濾孔的濾膜過濾,低溫凍存貯備用;用時取1分適應培養(yǎng)基+2分培養(yǎng)基混合使用。
使用飼細胞(Feeder Cells)。制備方法:
1. ? ? ?取原代培養(yǎng)的人或動物胚胎成纖維細胞,90%匯合時制成細胞懸液,再按105細胞/毫升重新接種培養(yǎng)。
2. ? ? ?在細胞半?yún)R合時,準備0.25μg/ml的絲裂霉素C,按2μg/106細胞的量加入到培養(yǎng)瓶中過夜;或用射線單次照射,劑量30~50戈瑞。
3. ? ? ?細胞經(jīng)上述處理后,Hanks液漂洗兩次、更換培養(yǎng)液、再培養(yǎng)24小時,胰蛋白酶消化細胞制成懸液,按5×104(104細胞/cm2)接種入新培養(yǎng)基中。
4. ? ? ?48小時后,即可用于細胞克隆之用。
底物特殊處理:
1. ? ? ?制備濃度為1 mg/ml的多聚右旋賴氨酸的水溶液,用以濕潤培養(yǎng)瓶底。
2. ? ? ?倒出多聚賴氨酸溶液,用5ml PBS沖洗一次后,可立即使用,或存數(shù)周內使用。
4)球體細胞培養(yǎng)
1. ? ? ?瓊脂鋪底的培養(yǎng)瓶:30ml無菌培養(yǎng)瓶,每瓶中加5 ml 2%瓊脂培養(yǎng)基,冷卻,形成平坦底層后備用。
2. ? ? ?取生長狀態(tài)良好已連接成片的細胞,用彎頭吸管伸入瓶內,把細胞縱橫割劃成若干小區(qū)后,倒出培養(yǎng)液。
3. ? ? ?加入0.25%的胰蛋白酶液,在倒置顯微鏡下邊消化邊觀察,當細胞小區(qū)邊緣微卷起后便立即終止消化,倒出消化液,用Hanks輕輕漂洗一次,加入新培養(yǎng)液3~5 ml,用吸管把已松動的細胞片吸打下來,分裝入1~3個含2%瓊脂培養(yǎng)基底層的培養(yǎng)瓶中,置溫箱繼續(xù)培養(yǎng),數(shù)日后便可生長成細胞球體。
4. ? ? ?換液:培養(yǎng)1~2日后,如需換液,微傾斜培養(yǎng)瓶,令培養(yǎng)液集于培養(yǎng)瓶底角,停片刻,待球體細胞下沉后,吸除部分培養(yǎng)液,再補充新培養(yǎng)液。
5)微載體細胞培養(yǎng)法
1. ? ? ?微載體選擇:先用利用三種小量微載體做培養(yǎng)實驗,觀察細胞在一定時間內細胞的吸著率和計算細胞數(shù),以得到最大量細胞為佳。
2. ? ? ?水化:稱一定量的微載體放入容器中,按每克微載體加50~100ml的比例,加入無Ca2+和Mg2+的磷酸緩沖液(PBS),室溫下放置應不少于3小時,并不時輕微攪動,然后再用新鮮PBS洗一次。
3. ? ? ?消毒:可采用高壓蒸汽消毒,也可在水化后用70%酒精浸泡消毒,再用無菌的PBS漂洗一二次。
4. ? ? ?傳代培養(yǎng):在連續(xù)進行微載體培養(yǎng)時,可以不必把細胞從微載體分離下來,可將帶有細胞的微載體和新的微載體混合進行培養(yǎng)細胞能移動到新載體上。如果進行其它實驗或需要分離細胞進行傳代培養(yǎng)時,和常規(guī)培養(yǎng)相同,先用EDTA+胰蛋白酶溶液作用使細胞脫離微載體表面。細胞脫離微載體后,可用自然沉降法,即在室溫下靜止5分鐘,微載體將先自沉在底部,細胞大部分仍在上清中,然后離心上清即可得到細胞。如果需要分離程度較高時,需用孔徑為100微米的尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)過濾后,再離心濾過液,就可得到較純凈的細胞。
6)懸浮培養(yǎng)法
懸浮培養(yǎng)是使帖壁細胞呈懸浮狀態(tài)生長。如所需培養(yǎng)的細胞本身屬懸浮生長型,則無須做任何處理;在傳代時先做離心處理去除舊培養(yǎng)液,添加新培養(yǎng)液即可。但在培養(yǎng)帖附型細胞時,必須進行干擾細胞不能帖附,方法有二:
1.用大培養(yǎng)瓶增加含有鐵芯的無毒的聚苯乙烯棒,在培養(yǎng)中進行電磁攪拌,使細胞不能帖壁而成懸浮培養(yǎng)。
2.用試管培養(yǎng)細胞,把試管置入帶有旋轉鼓的特制溫箱中進行培養(yǎng),旋轉鼓不停徐緩轉動,干擾細胞帖壁遂成懸浮培養(yǎng)。